EdU細胞增殖成像分析試劑盒

產(chǎn)品描述
細胞增殖是評價細胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標。EdU (5-Ethynyl-2`- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其連有的炔烴基團在天然化合物中很少見，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復(fù)制的DNA分子中，通過基于EdU與熒光染料的特異性共軛反應(yīng)，把熒光基團標記到新合成的含有EdU的DNA上面，這樣可以進行高效快速的檢測出DNA復(fù)制活性，此技術(shù)廣泛應(yīng)用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA損傷修復(fù)等方面的研究。
傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法需要DNA變性、抗原修復(fù)、抗原抗體過夜孵育等復(fù)雜繁瑣的操作步驟。而EdU檢測方法不需要劇烈的DNA變性，只需溫和的細胞固定化和透化處理，能夠較好地保護細胞形態(tài)、DNA整體結(jié)構(gòu)及細胞內(nèi)抗原識別位點，操作步驟更加快速、靈敏和準確。EdU與胸腺嘧啶(T)結(jié)構(gòu)非常相似，大小卻只有BrdU抗體的1/500，很容易在細胞內(nèi)擴散；無需抗原抗體反應(yīng)，能在細胞和組織水平更快速便捷地反映DNA復(fù)制活性。
訂購信息

產(chǎn)品組分

運輸與保存
藍冰運輸。-20℃保存，有效期12個月。
使用方法（以24孔板，HK2貼壁細胞為例）
本試劑盒是采用成像檢測方法進行檢測，適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。以下方式適用于貼壁細胞；非貼壁細胞可在孵育EdU后進行細胞涂片處理，固定后再采用貼壁細胞的染色流程進行檢測。
EdU標記
1.將細胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU標記培養(yǎng)基。
2.提前將2×EdU標記培養(yǎng)基預(yù)熱，然后將150微升2×EdU標記培養(yǎng)基與等體積細胞培養(yǎng)基混合，獲得1×EdU溶液。
【注】：①不建議替換全部培養(yǎng)基，這樣可能會影響細胞增殖的速度。②配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒過細胞為宜。
3.孵育細胞2 h，棄培養(yǎng)基。
【注】：①培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài)。②大多數(shù)腫瘤細胞以及粘附細胞系均可采用2 h的孵育時間。
4.以1xPBS清洗細胞兩次，每次5 min, 以除去未摻入DNA的EdU殘留。
【注】：對于貼壁不牢的細胞可降低清洗強度。
細胞的固定和通透
1.每孔加入150μL 4%多聚甲醛細胞固定液，室溫培養(yǎng)30 min，棄固定液。
2.每孔加入150μL 2mg/ml甘.an.suan，搖床孵育5 min，以中和過量的多聚甲醛。
3.棄甘.an.suan.溶液，每孔加入300μL PBS 洗液，室溫清洗5 min。
4.每孔加入 300μL 0.5% Triton X-100 細胞通透液，室溫通透10 min，棄細胞通透溶液。
5.每孔加入300μL PBS洗液，室溫清洗 5 min。
EdU染色
1.通過用10：1去離子水稀釋反應(yīng)緩沖液，進行配制1×反應(yīng)緩沖液。
2.按照溶解200 mg緩沖添加劑溶于1 mL 去離子水的比例稱取適量的粉末進行溶解，即為可用的緩沖添加劑的濃度，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。
【注】：緩沖添加劑為白色粉末，較難準確稱量，稱量范圍可稍微放寬，但是不應(yīng)超過±20%，且該粉末較易氧化，使用后請旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需報廢或更換。
3.按照以下的表格進行染色反應(yīng)液的配制：

4.每孔加入100 μL配置好的檢測混合液，以覆蓋細胞為宜，避光、室溫孵育30 min。
5.棄染色反應(yīng)液，加入300 μL 0.5% Triton X-100細胞滲透液清洗2-3次，每次10 min。
6.棄細胞滲透液，用PBS洗兩次，每次 5 min。
DNA染色
1.將Hoechst 33342 *超級純*（李記貨號：AC12L021）用PBS溶液1：1000進行稀釋得到1×Hoechst染色液。
2.每孔加入150 μL 1×Hoechst染色液，室溫避光孵育20-30 min后，棄染色液。
3.每孔加入300 μL PBS洗細胞兩次，去掉洗液。
圖像獲取及分析
　　建議染色完成后立即進行熒光顯微鏡拍照觀察；如果條件限制，請于4℃條件下避光濕潤保存3 d之內(nèi)完成拍照。若為細胞爬片或涂片，可使用抗熒光淬滅封片劑進行封片后于4℃條件下保存及拍照檢測。

注意事項

1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
   

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